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基因工程中独特的酶消化和双重消化

来源:365bet线日期:2019-06-14 07:59 浏览:
分析:根据问题的含义,BamHI应该用于单一消化。
得到的目的基因D与质粒两端的粘性末端相同。
由于靶基因和载体在连接反应过程中随机碰撞,因此两端的粘合剂末端是相同的。
因此,D基因可以与质粒正向连接(正连接),即,靶基因从顶部到底部顺时针连接(以某种方式根据启动子的方向)。由于产生了所需的蛋白质并且通过从上游到下游的转录表达产生了所需的性状,因此靶基因也可以与质粒反向连接(延伸)。从下到上,所有密码子都发生变化,靶基因不能正常表达。
双酶消化通常用于实验以防止抗结合现象。
用两种不同的限制酶同时处理两种双重消化物和双重消化物,即靶基因和质粒。
由于限制酶是特异性的并且不同的酶作用于不同的碱基序列,因此产生的粘性末端也是不同的。
当使用DNA连接酶进行连接时,如果没有反连接问题,则只能进行正连接。
因为它可以有效地防止切割现象,所以双重消化被广泛用于基因工程中的表达载体的构建,并且还可以用于制备体外转录的模板。
RNA干扰(RNAi)是同源mRNA被双链RNA(dsRNA)特异性降解并且可以靶向停止特定基因表达的现象,因此它在本领域中被广泛使用。它被使用了。生物学的许多领域。
为了有效地沉默基因,必须获得具有与基因相同序列的dsRNA,并且制备dsRNA的方法需要双酶消化和单酶消化方法。
制备dsRNA的方法
通常,选择称为pLITMUS28i的质粒。该质粒的特征在于具有相反转录方向的两个T7启动子和两个启动子之间共有的几个切割位点。
首先,通过双酶切(BamHI和EcoRI)同时处理靶基因和质粒pLITMUS28i,并在连接后获得重组质粒:将重组质粒分成两份并分别用BamHI和EcoRI消化。为了获得转录模板:在室温下体外转录RNA聚合酶和四种核糖核苷酸(NTP)以获得单链RNA。
因为这些单链RNA本身是互补的,所以dsRNA可以通过在低温下退火来制备,并且可以通过将脂质体转移到相应的受体细胞用于RNAi相关实验。。
- 杜端阳
基因工程中的单一消化和双重消化
教授生物学
2016年第六期